【BioSpherix间歇性高低氧培养箱】

“我们”服务于睡眠呼吸暂停综合征研究

睡眠呼吸暂停综合征（OSAS），是指睡眠时，由于上呼吸道的狭窄或者塌陷造成的睡眠时呼吸低通气或者呼吸停顿，长期患病者可以导致高血压、冠心病、糖尿病等一系列的综合症。它分为阻塞型、中枢型和混合型三大类，以阻塞性最多见。

近期北京市的调查中发现鼾症的患病率为 13.4%。其中随着年龄增加，患病率不断上升，61-70 岁的鼾症患病率达到 23.6%。而睡眠呼吸暂停的患病率为 3.1%。美国有学者认为 60 岁以上鼾症的患病率为 50%，美国成人男性睡眠呼吸暂停发病率为 9%，女性 4%。想想我们身边的人，五个人中可能就有一个OSA的患者。

睡眠呼吸暂停综合征的危害是多方面的，对人体的影响也是系统性的：包括心血管系统中高血压、心律失常等；内分泌中胰岛素抵抗、糖代谢异常等；诱发呼吸衰竭、加重哮喘，还可引起难治性的慢性咳嗽、肺动脉高压、肺栓塞，甚至肺间质疾病等。病人表现为注意力下降、认知功能下降，出现焦虑、抑郁等情绪症状。

人们对OSAS慢性间歇性缺氧的探索从未中断，下面我们一起来看两篇针对此方向的深入研究。

案例一

Delayed Neutrophil Apoptosis in Patients with Sleep Apnea

期刊：American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine(IF=21.405)

摘要：以间歇性缺氧/复氧（IHR）为特征的阻塞性睡眠呼吸暂停（OSAS）与动脉粥样硬化相关。中性粒细胞（PMN）通过在PMN与内皮细胞的相互作用中产生氧化自由基和蛋白水解酶参与动脉粥样硬化的形成。一般来说，缺氧促进细胞凋亡。然而，与其他细胞不同，在中性粒细胞中，缺氧严重抑制细胞凋亡。

方法：采用流式细胞术检测全血中性粒细胞凋亡和粘附分子的表达，并通过各种培养条件和形态学进行验证。同时，将全血和纯化的中性粒细胞暴露于IHR和体外持续缺氧中。

将全血或纯化的中性粒细胞暴露于三到六个周期的间歇性缺氧中。空气相设定值包括35分钟的缺氧期，然后25分钟的复氧（21%O2和5%CO2），使用BioSpherix Oxycler C42系统（BioSpherix，Redfield，NY）。在每个1小时的周期中，实际血氧饱和度分别保持在2%或6%，持续时间为6.6, 6 ,3.6分钟或6.55, 6, 2.75分钟。持续缺氧（SH）的持续时间相同（血液中实际含氧量的2%）。对照组治疗后的血液在常氧条件下维持相同的时间。浸入血液中的氧电极连续监测溶解氧浓度。

图1.与常氧相比，间歇性缺氧/复氧（IHR）和持续缺氧（SH）对健康受试者多形核白细胞（PMN）凋亡测量的体外影响。（A） 流式细胞术检测全血中性粒细胞中粘附分子CD16的低表达。（B） 经荧光DNA结合染料Hoechst 33342染色的纯化中性粒细胞的细胞自旋制备的代表性显微照片，显示染色质凝聚和凋亡小体的明亮荧光。与常氧相比，SH中的荧光较低，IHR处理的PMN中的荧光最低。（C） 经May Grunwald Giemsa染色的纯化中性粒细胞的细胞自旋制备的典型显微照片。凋亡的中性粒细胞通过密集的染色质凝聚来鉴定，要么是单个核，要么是核碎片。细胞凋亡在常氧状态下最高，在IHR状态下较低。在IHR治疗中，将血样（A）或纯化的中性粒细胞（B、C）暴露于六个周期。每个周期持续一小时。在缺氧期间，实际血液O2浓度为2%，持续时间为6.6-3.6分钟。在常氧期间，血液O2在14.0 6 1.5分钟内恢复到15%以上。在SH治疗中，整个期间实际血液或介质O2浓度保持在2%。对照组在常氧条件下（21%O2，5%CO2与N2平衡）维持相同的时间。在所有处理中，二氧化碳保持不变（5%）。

图2.睡眠呼吸暂停中白细胞在内皮细胞损伤中的作用示意图。在常氧条件下，白细胞在血流中自由流动，内皮细胞处于非激活状态。然而，粘附分子的基本水平在白细胞和内皮细胞表面以低水平表达。

主要结论：本研究首次证明，在中重度OSAS患者中，PMN凋亡延迟。凋亡的中性粒细胞百分比与OSAS严重程度呈负相关；OSAS中性粒细胞凋亡减少，粘附分子表达增加。虽然粘附分子可能促进PMN与内皮细胞相互作用的增加，但凋亡的减少可能进一步增强这些相互作用，促进自由基和蛋白水解酶的释放；OSAS患者中性粒细胞凋亡减少，粘附分子表达增加。白细胞与延迟的中性粒细胞凋亡共同对OSAS患者的内皮细胞构成动脉粥样硬化威胁，可通过鼻持续气道正压通气有效治疗。

案例二

bnormal lipid droplets accumulation induced cognitive deficits in obstructive sleep apnea syndrome mice via JNK/SREBP/ACC pathway but not through PDP1/PDC pathway.

期刊：Molecular Medicine

摘要：慢性间歇性低氧(CIH)导致认知障碍的机制尚不清楚。但在这里，我们的研究发现，约3个月的CIH治疗诱导C57BL/6小鼠海马神经和胶质细胞中的脂滴(LDs)积聚，并引起严重的神经损伤，包括神经元损伤、成神经细胞(NB)凋亡和异常的胶质细胞活化。也就是说OSAS造成的CIH，可引起严重的神经认知功能障碍，与海马形态学的区域性改变有关；脂质代谢紊乱导致神经和神经胶质细胞损伤，最终导致行为功能障碍。

方法：SMND-309提取自丹参。给药后可在大鼠脑中检测到其为丹酚酸B的新代谢产物.研究证明309通过抗凋亡、抗炎和抗氧化作用促进神经元存活。在这项研究中，SMND-309被腹膜内注射到小鼠体内，以减轻CIH引起的神经损伤。这可能有助于开发潜在的治疗OSAS的药物靶点。

CIH：

小鼠每天从上午8:00到下午4:00暴露在CIH/室内空气(RA)条件下，持续约3个月。在暴露期间，将WT + CIH组和SMND-309 + CIH (3-FP + CIH)组中的小鼠放入CIH室(BioSpherix OxyClycler A84，美国)，将WT + r A组和SMND-309 (3-FP)组放入RA室(BioSpherix OxyClycler A84，美国)。首先，这个小室充满了氮气持续85-95秒，氧气水平从21%±1%(正常)降至7%±1%(缺氧)。然后，氧气水平在15-20秒内保持在7%±1%。最后，氧气水平在45-50秒内恢复到21%±1 %,并持续15-20秒。CIH循环持续约180秒，每小时约20个循环。RA舱内的氧气水平始终保持在21%±1%。

IH：

通过在安装在培养箱内的氧气控制柜(Biospherix Oxycycler C42)中培养细胞来诱导IH，该氧气控制柜配备有用于连续监测氧气水平的氧气传感器。氮氧和5%二氧化碳的混合物输注，氧水平包括30分钟的低氧期(3% O2)，随后是30分钟的复氧期(21% O2).实际O2在每个1小时的循环中，饱和度保持在3% 10分钟，进行3天。

图3.SMND-309的研究过程和结构。A.研究工作流程。在7天的适应后，小鼠暴露于CIH条件下约3个月，并在最后一周用SMND-309治疗。CIH暴露结束后，立即进行行为测试。B.CIH治疗计划。红线代表设定点。蓝线代表实际的含氧量。C.SMND-309的结构

图4.DG区的病理变化。A.海马的H&E染色。在WT + CIH组的SGZ中，几乎没有观察到NBs(白色箭头)，但是SMND-309治疗减轻了损伤。原始放大倍数:400倍。B.海马的透射电镜结果。WT + CIH组的神经元表现出细胞质空泡化、LDs积聚(黑色箭头)和线粒体破裂(黑色三角形)。此外，WT + CIH组的神经胶质细胞出现水肿(黑星)，尤其是在血脑屏障周围区域。原始放大倍数:15000倍。所有实验重复三次。

主要结论：SMND-309是丹参，已应用于神经保护，SMND-309治疗通过减少DG区神经和神经胶质细胞中LDs的积累来改善CIH小鼠的行为表现。这些发现可能有助于提供一种新的潜在的神经保护疗法。在这项研究中，CIH诱导的海马损伤是由NBs、神经元和神经胶质细胞中LDs的积累触发的。LDs的产生可通过JNK/SREBP/ACC途径调节。SMND-309治疗减轻了这些损伤。迄今为止，LDs在神经细胞中的作用仍有争议。脂质合成障碍和LDs异常积聚机制仍不清楚。所有这些问题都需要进一步研究。

在对OSAS的研究中，无论是以细胞还是动物为实验建模对象，都离不开间歇性缺氧这个实验条件，在两份研究中，能精准控制中性粒细胞和小鼠缺氧暴露时间与浓度的设备，都是来自Biospherix的产品：

01 OxyCycler C42高级动态可编程氧气控制系统

动态双通道/双气体控制器。可同时连接两个C-chamber,各自独立编程。

动态氧气编程，氧气设置0.1-99.9%，二氧化碳设置0.1-20.0%

外接CO₂、N₂和O₂三个气瓶，轻松实现急性高氧/缺氧、慢性缺氧和高/低氧交替控制

可同时独立编程控制两个腔室的气体浓度曲线

通过电脑软件，可预编程和存储不同的气体浓度升降位点、持续时间以及循环次数，实时记录和存储气体浓度等数据。

02 OxyCycler A840V动态编程氧气控制系统

可动态设定氧气浓度（0.1-99.9%），可同时控制4个动物笼,，独立运行不同的程序

可以轻松完成程序式低氧/高氧控制

可快速达到氧气浓度设定值，并循环程序1-999次或无限

可选配监控器，快速检测到气体浓度中断并及时修正

电脑操作界面，实时记录探头反馈数据，显示趋势图表

参考文献：

【1】Dyugovskaya L, Polyakov A, Lavie P, Lavie L. Delayed neutrophil apoptosis in patients with sleep apnea. Am J Respir Crit Care Med. 2008 Mar 1;177(5):544-54. doi: 10.1164/rccm.200705-675OC. Epub 2007 Nov 15. PMID: 18006889.

【2】Li, D., Xu, N., Hou, Y. et al. Abnormal lipid droplets accumulation induced cognitive deficits in obstructive sleep apnea syndrome mice via JNK/SREBP/ACC pathway but not through PDP1/PDC pathway. Mol Med 28, 3 (2022). https://doi.org/10.1186/s10020-021-00427-8

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