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文献与应用 | BEX品牌CUY21 EDIT II在免疫方面的应用
来源:      时间:2023-07-18

01
.产品介绍
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CUY21为全球的转基因研究开创了诸多全新方向。最新款CUY21EDITII采用先进的脉冲芯片控制技术,BEX的多步脉冲、反向脉冲及恒流脉冲转化模式,无需任何专用试剂,提供高效高存活率的转化。


02
.主要应用
  • 细胞的高效转染,尤其适合于原代细胞、免疗细胞、干细胞等难转染细胞的高效高存活率转化

  • 在体/离体受精卵CRISPR/Cas9高效基因编辑

  • 体内基因转染(in-utero,in-vivo,in-ovo)

  • 体外基因转染(ex-ovo,ex-vivo)

  • 贴壁细胞基因转染


03
.专业突出性能

1.先进组合脉冲技术,针对不同样品皆可提供完美的转化效果,真正一机多能。

1.1 Decay(V)+Square(V)组合模式:

高压瞬时穿孔脉冲+低压导入脉冲(动态衰减/静态衰减)+反转脉冲。主要用于悬浮和贴壁细胞的基因转染。

1.2 Square(V)方波电压模式:

释放方波脉冲,主要用于活体转基因。 

1.3 Sauare(mA)恒流方波模式:

恒流脉冲是突破性的脉冲技术,可满足极其脆弱组织或细胞的高效基因转染。

小鼠在体受精卵CRISPR/CAS9基因编辑是目前全新的研究方向,利用恒流转化模式可以获得高生存率和高转化效率的实验结果。

2.无需任何额外的转染试剂

BEX公司研发了日本乃至全球精密可靠的脉冲技术,包括组合脉冲,反转脉冲,衰减脉冲,恒流脉冲等,可以无需任何专用转染试剂,即可实现高效转染。这些技术也被其他公司部分采用。

3.大屏幕直观设定转化参数,并实时监测显示实际实验数据

5.7寸大屏幕显示设定参数,实时电压,电流检测值,脉冲波形,让整个转化过程一目了然,并保证了实验的可重复性。

04
.应用方向—免疫方面
1.受精卵基因编辑
2015年,日本千叶大学的Masakazu Hashimoto以及德岛大学的Tatsuya Takemoto,使用日本BEX公司CUY21EDIT II多模式电转化仪,首次发明了CRISPR/Cas9技术为基础的小鼠受精卵/胚胎离体基因编辑,相关研究成果发表于Developmental Biology等期刊。成为建立基因编辑小鼠模型的研究者争相效仿的黄金方法。

CUY21EDIT II独有的恒流转化模式,发明了受精卵在体输卵管转化(i-GONAD法)。这一方法的出现,较之上面的离体受精卵基因编辑方法又有了突破性进展。

应用案例

为了鉴定参与外胚层谱系形成的BET蛋白,我们分析了缺乏Brd4Brd2和双突变体的突变胚胎。只有在Brd4/Brd2双缺陷桑椹胚中,NANOG阳性外胚层细胞的消失才明显。因此,JQ1处理的胚胎的表型不是通过Brd4-Brd2单缺陷而复制的,而是仅通过Brd4/Brd2双缺陷复制的,证明了Brd2Brd4在外胚层谱系的重要作用[1]

为了获得基因敲除胚胎,使用CUY21 EDITII、GE-101铂板电极(长10 mm,宽3 mm,高0.5 mm,间隙1 mm)和GE-1电极夹(日本东京BEX有限公司)对Brd2tg/tg卵母细胞进行电穿孔得到。

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图1 CRISPR-Cas9系统通过CUY21EDIT II电转仪生成Brd2+/+Brd4-Brd2tg/+
Brd4-Brd2tg/tgBrd4-基因敲除胚胎的策略示意图。


2.外泌体载药
外泌体,活细胞释放到细胞外微环境的磷脂双分子囊泡,其直径大小约为30~150nm。因天然外泌体内部富含脂质、蛋白质和核酸等物质的特性,近年来外泌体作为药物递送载体受到了越来越多研究者们的关注。

CUY21EDITII电转仪通过对外泌体囊泡施加适当的电流击穿形成囊泡微孔,药物通过形成微孔加载到外泌体中,外泌体膜随后会很快恢复完成封装。CUY21EDIT II独特的动态衰减脉冲技术及恒流电阻测定技术使转染过程中电流输出更稳定从而高效封装药物载入外泌体中。

应用案例

MicroRNA(miRNA)是关键生物过程中基因表达的重要调节因子,是糖尿病伤口治疗领域的一种有前景的核酸药物。在Chengqi Yan等人的研究中使用牛奶来源的外泌体作为miR-31-5p递送的新系统,并通过CUY21EDIT II (BEX, Japan) 电转仪电穿孔成功地将miR-315P模拟物封装到牛奶外泌体内该研究证明了加载在外泌体中的miR-31-5p实现了更高的细胞摄取并能够抵抗降解并且miRNA-外泌体在体外显著改善了内皮细胞功能,同时在体内促进血管生成和增强糖尿病伤口愈合[2]

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3. 核酸疫苗
核酸疫苗(nucleic acid vaccine),也称基因疫苗(genetic vaccine),是指将含有编码的蛋白基因序列的质粒载体,经肌肉注射等方法导入宿主体内,通过宿主细胞表达抗原蛋白,诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗是利用现代生物技术免疫学、生物化学、分子生物学等研制成的,分为DNA疫苗和RNA疫苗两种。

应用案例

尽管存在有效的抗病毒治疗,但没有治愈或预防性疫苗,HIV-1仍然是世界范围内的一个主要公共卫生问题。病毒感染与宿主特异性免疫的许多逃逸机制有关,而且保护的相关性仍然不完全清楚。受减毒活病毒疗效的启发,Leroy等人已经开发了一种创新的DNA 疫苗 CAL-SHIV-IN-IRES IL-7和 CAL-SHIV-IN-IRES IL-15。

我们将两种DNA 疫苗 CAL-SHIV-IN-IRES IL-7和 CAL-SHIV-IN-IRES IL-15通过皮内注射+电穿孔(使用CUY21EDIT II (BEX, Japan) 电转仪 10 mm 直径的LF567电极进行电穿孔)以及肌肉注射 (IM)联合免疫BALB/cJ 小鼠和恒河猴,检测两种共同注射的DNA 疫苗在小鼠和恒河猴体内的免疫原性,并将免疫应答与亲本疫苗 CAL-SHIV-IN-产生的免疫应答进行了比较。这种联合免疫在小鼠和恒河猴体内都引发了有效的疫苗特异性 CD4和 CD8T 细胞。免疫后40周,恒河猴的血浆和粘膜隔室均检测到 ADCC作用(ADCC)抗体,并被细胞因子增强[3]

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图2  BALB/cJ 小鼠免疫:第一组 20 只小鼠用 CALSHIV-IN- 疫苗免疫;第二组20只小鼠用 CAL-SHIV-IN-IRES IL-7 和 CAL-SHIV-IN-IRES IL-15 通过皮内注射+电穿孔 (ID/EP) 和肌肉注射 (IM) 联合免疫。6周后给予同源疫苗加强剂。在免疫后第 2、4、8 和 10 周,采集脾脏以监测和评估细胞反应和血液样本,以检测血清中的 HIV 特异性抗体。
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图3 猕猴的免疫接种和取样。第一组3只猕猴用 CALSHIV-IN- 疫苗免疫;第二组3只猕猴用 CAL-SHIV-IN-IRES IL-7 和 CAL-SHIV-IN-IRES IL-15 通过皮内注射+电穿孔 (ID/EP) 和肌肉注射 (IM) 联合免疫。16周后进行了同源疫苗的强化。采集不同的样本来监测和评估40周内的免疫反应。

参考文献:

[1] Tsume-Kajioka M, Kimura-Yoshida C, Mochida K, Ueda Y, Matsuo I. BET proteins are essential for the specification and maintenance of the epiblast lineage in mouse preimplantation embryos[J]. BMC Biol, 2022,20(1):64-70.

[2] Yan C, Chen J, Wang C, et al. Milk exosomes-mediated miR-31-5p delivery accelerates diabetic wound healing through promoting angiogenesis[J]. Drug Deliv, 2022,29(1):214-228.

[3] Leroy LA, Mac Donald A, Kandlur A, Bose D, Xiao P, Gagnon J, Villinger F, Chebloune Y. Cytokine Adjuvants IL-7 and IL-15 Improve Humoral Responses of a SHIV LentiDNA Vaccine in Animal Models[J]. Vaccines (Basel), 2022, 10(3):461-483.